PCR技術(shù)及其在生物和醫(yī)學中的應用

  PCR已經(jīng)對生物學產(chǎn)生了變革性的影響，因為它可以將極少量的DNA擴增到可以分析的數(shù)量。以前，增加DNA數(shù)量的唯一方法是利用細菌來產(chǎn)生更多副本。這個過程非常耗時，需要將DNA片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒或其他載體中，將組合的DNA引入細菌細胞，培養(yǎng)大量細菌，然后再次從細菌中純化DNA片段。使用PCR，可以快速大量生成特定的DNA序列，而無需將DNA轉(zhuǎn)移到細菌中來產(chǎn)生副本。這使得純化DNA片段變得更加容易。

  與生物體不同，PCR只能復制短DNA片段，通常長度不超過10千堿基對(kb)。有些技術(shù)可以復制長達40kb的片段，這仍然比真核細胞的染色體DNA短得多。例如，人類細胞有大約30億個堿基對，遠遠超過PCR可以復制的最大DNA長度。

  PCR已成為研究實驗室中用于多種用途的必備工具，例如基因克隆、測序和測量基因表達。此外，它在醫(yī)學上還用于準確識別微生物，包括單個病原體或多種生物群，例如腸道微生物群中的微生物。

  在醫(yī)學和生物研究實驗室中，PCR是一種常用技術(shù)，用于各種目的，包括識別遺傳疾病、建立基因指紋、診斷傳染病、克隆基因、進行親子鑒定和DNA計算。

  PCR過程如何進行？

  PCR需要幾個基本組分的存在，包括：

  1.包含要擴增的DNA片段的DNA模板或cDNA。

  2.兩個引物，用于識別要擴增片段的起點和終點

  3.Taq聚合酶，它復制要擴增的片段。

  4.核苷酸，是DNA聚合酶合成新DNA鏈的組成部分。

  5.緩沖溶液，為DNA聚合酶的功能提供適當?shù)幕瘜W環(huán)境。

  PCR反應在熱循環(huán)儀中進行，熱循環(huán)儀是一種能夠精確加熱和冷卻其中的反應管以達到每個反應階段所需溫度的設備。為了防止反應混合物蒸發(fā)，在反應管頂部放置加熱蓋，或在反應混合物表面添加一層油。

  在深入研究PCR過程之前，徹底了解其基本原理非常重要。PCR依靠四種核苷酸堿基，即腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤，即使來自有限的來源，也能擴增高質(zhì)量的DNA片段。通常，單個PCR循環(huán)涉及30-35次重復，大約需要兩個小時才能生成可用量的DNA片段。通過結(jié)合多重PCR、RT-PCR、嵌套PCR、反向PCR、菌落PCR、不對稱PCR、解旋酶PCR、連接介導PCR等細微變化，可以定制PCR以產(chǎn)生更好的結(jié)果。PCR反應涉及20-40個循環(huán)，每個循環(huán)有三種不同的溫度。

  PCR每個循環(huán)包含三個關(guān)鍵步驟，包括變性、引物退火和最終延伸。

  變性

  PCR中的變性過程包括將DNA樣本加熱到95°C左右，通過破壞兩個互補堿基之間的氫鍵將雙鏈DNA分離為單鏈DNA。在標準PCR反應中，此變性階段通常需要15-30秒。

  引物退火

  第二步稱為退火，溫度降低到60°C左右。這允許引物附著到DNA樣本中的互補序列上，并且溫度保持約15-60秒，具體取決于引物的長度。較長的引物與精確目標序列的結(jié)合更特異性。退火溫度足夠低，以使引物堿基與目標DNA形成氫鍵，并且它根據(jù)目標DNA和引物的序列確定。

  最終延伸

  第三步是延伸或延長，此時溫度升高到所用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的理想溫度，通常約為72°C。在此溫度下，DNA聚合酶使用核苷酸延伸或延長引物，從而產(chǎn)生新的互補DNA鏈。延伸階段的持續(xù)時間取決于目標DNA的長度，目標越長，DNA聚合酶需要的時間就越長，才能產(chǎn)生完整的副本。

  PCR在生物學和醫(yī)學中的應用

  PCR在醫(yī)學領(lǐng)域的主要應用之一是快速診斷。研究人員已經(jīng)能夠使用PCR快速識別HIV、單純皰疹病毒(HSV-2)等病毒以及白色念珠菌等真菌種類，幫助醫(yī)生比傳統(tǒng)檢測方法更快地確診。事實上，由于其靈活性和準確性，PCR已成為識別臨床環(huán)境中相關(guān)病原體的不可或缺的工具。

  PCR的高靈敏度也使其在診斷罕見疾病時從其他實驗室技術(shù)中脫穎而出，因為與疾病相關(guān)的基因突變可能僅發(fā)生在少數(shù)細胞中。

  除了檢測病原體，PCR還可用于通過量化mRNA水平來評估樣本中的基因表達水平。這可提供有關(guān)細胞健康的有用信息，并可幫助醫(yī)療專業(yè)人員診斷癌癥或嚴重疾病。

  在生物學研究領(lǐng)域，PCR仍然在世界各地的現(xiàn)代實驗室中發(fā)揮著重要作用，因為它可以深入了解生物體如何進化以及生物體如何相互作用。它還可用于分析以前未表征的基因或通路以及從群體中篩選突變體。由于其廣泛的實際應用，自三十年前推出以來，無數(shù)科學家一直在使用PCR——使其成為當今研究人員可以使用的最強大的分子工具之一。

  在研究和診斷中檢測DNA序列

  PCR一直是用于在研究和臨床診斷中檢測DNA序列的有力工具。從歷史上看，限制性酶使研究人員能夠檢測和分析各種基因異常，但PCR可以用更少的樣本材料提供更精確的結(jié)果。PCR確實存在一些缺點，在考慮將其用于特定應用時必須權(quán)衡這些缺點。由于該方法依賴于獲取要擴增的特定DNA序列，因此目標序列內(nèi)的任何變化都可能導致結(jié)果無用或不準確。此外，由于其特異性，應始終使用其他檢測或測序方法（如桑格測序）進一步確認研究結(jié)果。但也許最重要的是考慮與其他方法相比的成本——有時根據(jù)可用資源，其他流程可能更合適。

  PCR在檢測DNA序列方面具有深遠的意義，并且已被證明是推動研究和診斷發(fā)展的關(guān)鍵。這些進步為更深入地了解遺傳組成和識別可能被忽視的疾病提供了巨大的機會。